青岛 修车群
发布日期：2025-12-17 14:34 点击次数：158最近miRNA畛域竟然取得了诺贝尔奖，是以我也凑一下吵杂念念学习，是以就委托神通广泛的曾安分提供了一个miRNA测序数据案例，这个数据集是GSE181922，其中一共包括了40例样品的的miRNA数据。如下所示：
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miRNA的上游分析进程跟mRNA的上游进程很相似：环境部署——数据下载——稽察数据(非质控)——数据质控清洗——数据比对——数据定量https://www.bilibili.com/video/BV1zK411n7qr图片
1.基于conda的环境部署/软件装置：尝试使用ARM架构(M1/M2芯片) 去装置fastqc trim-galore hisat2 subread multiqc samtools salmon fastp，发现这些软件中有几个是不兼容的。是以需要改回原本的x86_64架构(Intel芯片)，如果非mac/M1/M2的不需要用这种相貌。
CONDA_SUBDIR=osx-64 conda create -n miRNA_x86_64 python=3.9 conda activate miRNA_x86_64 conda install -y -c bioconda sra-tools hisat2 bowtie samtools fastp bowtie2 fastx_toolkit fastqc conda install -y -c hcc aspera-cli conda install -y sra-tools2.下载相应数据库数据
miRbase是miRNA接洽畛域内最泰斗的数据库之一，提供了miRNAs序列以及笼统，定位，发夹序列等信息，以及提供定名办事。
mkdir mirna mkdir reference cd ./reference #nohup wget ftp://mirbase.org/pub/mirbase/CURRENT/hairpin.fa & #nohup wget ftp://mirbase.org/pub/mirbase/CURRENT/mature.fa & #gunzip hairpin.fa.gz #gunzip mature.fa.gz #不知为何，笔者这边一直出现一语气失败，着实没目的就径直从官网进行了点击下载
1. 前体 miRNA（hairpin.fa）：
识别新 miRNA： 通过比对发夹状序列，接洽东谈主员不错预计或识别新的 miRNA，因为重生成的 miRNA 在细胞内当先酿成发夹结构。结构分析： 发夹状结构是 miRNA 私有的二级结构，通过分析它的结构和序列特征，不错更好地了解 miRNA 的生成机制。料理和转机为老练 miRNA： 前体 miRNA 是老练 miRNA 的来源，前体文献不错匡助模拟或接洽 miRNA 在细胞内的生成过程，举例 Dicer 酶切割的具体位置和生成机制。2. 老练 miRNA（mature.fa）：
功能性分析： 老练 miRNA 是径直调控基因抒发的功能分子，不错聚首到特定的 mRNA 靶位点。mature.fa 文献不错用于 miRNA 靶向基因预计、通路分析和功能接洽。抒发定量： 在本色的抒发定量分析（如 RNA-seq）中，比对老练 miRNA 序列不错匡助准确识别 miRNA，并进行定量，从而用于下贱的互异抒发分析。基因调控聚积： 老练 miRNA 文献可用于构建 miRNA-mRNA 调控聚积，接洽 miRNA 在特定生物学过程中的作用。在这里这两个文献的作用主若是进行序列比对。
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3.Check 下载到土产货的数据掀开hairpin.fa文献不错看到数据的过错
cel-let-7 是序列称号。MI0000001 是 miRBase 数据库中对应的独一 ID。Caenorhabditis elegans 是该序列的来源物种。let-7 stem-loop 形色了该序列是 let-7 miRNA 的发夹环结构。紧接的两行是 let-7 的核苷酸序列。图片
cat hairpin.fa | grep '>'| awk '{print $3,$4}'| sort |uniq -c | wc -l # 265cat hairpin.fa: 读取 hairpin.fa 文献的系数内容，并输出到末端。grep '>': 筛选出包含 > 字符的行。FASTA 过错中，> 开端的行暗示序列的笼统信息，如 miRNA 称号和其他信息，而不是序列自己。awk '{print 图片
4} 暗示输出第三个和第四个字段（即以空格或制表符分隔的第三和第四部分）。在 miRNA FASTA 文献中，第三个和第四个字段可能是与 miRNA 称号和种类关系的信息。sort对索取的第三和第四字段进行排序。uniq -c: 统计每个独一的第三、四字段组合的出现次数。uniq -c 会对调换的行进行计数。举例，如果 miRNA_type1 出现了屡次，则会输出雷同 5 miRNA_type1。在使用 uniq 之前，必须先对内容进行 sort，不然无法识别调换的行。wc -l：统计输出的行数。wc -l 统计 uniq -c 输出的总行数，即不同 miRNA 类型组合的数目。cat mature.fa | grep '>'| awk '{print $3,$4}'| sort |uniq -c | wc -l # 265接着不雅察东谈主类这个物种的miRNA的数目
grep sapiens mature.fa |wc -l # 2656grep sapiens mature.fa | wc -l：grep sapiens mature.fa：从文献 mature.fa 中查找包含 "sapiens" 的行。| wc -l：将匹配的行数通过管谈传递给 wc -l，统计这些行的数目。最终复返包含 "sapiens" 的总行数。grep sapiens hairpin.fa | wc：grep sapiens hairpin.fa：从文献 hairpin.fa 中查找包含 "sapiens" 的行。| wc：wc 会复返三个值：行数、单词数、字节数。由于莫得加 -l 参数，恶果中会包含扫数这三个统计值，列出包含 "sapiens" 的行数、单词总和以及字符总和。
接着不雅察有若干序列，4步履一条序列
zless -S mature.fa | paste - - - - |wc -l # 24443 zless -S hairpin.fa | paste - - - - |wc -l # 30029
接着查验一下前体和老练体长度：
前体miRNA和老练体miRNA：前体miRNA长度一般是70-120碱基，常常是茎环(发夹，hairpin)结构。老练之后一般是22个碱基。(曾安分的perl的示例代码)
# 前体长度 awk '/^>/ {printf("\n%s\t",$0);next;} {printf("%s",$0);} END {printf("\n");}' < hairpin.fa | tr "\t" "\n" | grep -v '>' | awk '{print length}' | uniq -c | sort -n -k2 # 老练体长度 awk '/^>/ {printf("\n%s\t",$0);next;} {printf("%s",$0);} END {printf("\n");}' < mature.fa | tr "\t" "\n" | grep -v '>' | awk '{print length}' | uniq -c | sort -n -k24.构建索引构建 miRNA 序列的索引库（举例使用 bowtie 构建 hairpin.fa 和 mature.fa 的索引）不错权贵耕作后续比对过程的速率和准确性，比如：1. 加速比对过程；2. 减少贪图资源需求；3. 耕作比瞄准确性；
U->T调遣为什么要进行U-> T调遣：在 RNA 序列中，碱基用“U”（尿嘧啶）暗示，而 DNA 序列中对应的是“T”（胸腺嘧啶）。大大都比对用具，如 Bowtie，主若是针对 DNA 序列瞎想的，因此它们默意识别“ATCG”四种碱基。在这种情况下，如果不将 RNA 中的“U”调遣为“T”，比对用具会无法正确识别和比对 RNA 序列。
perl -alne '{if(/^>/){if(/Homo/){$tmp=1}else{$tmp=0}};next if $tmp!=1;s/U/T/g if !/>/;print}' hairpin.fa > hairpin.human.fa perl -alne '{if(/^>/){if(/Homo/){$tmp=1}else{$tmp=0}};next if $tmp!=1;s/U/T/g if !/>/;print}' mature.fa > mature.human.faperl -alne '...'： perl：调用 Perl 剧本。-a：启用自动分段景观，将每行分割成字段，保存在 @F 数组中（这里未用到 @F）。-l：自动料理换行符，使输出更整王人。-n：轮回读取每一瞥，但不会自动打印输出。if(/^>/){if(/Homo/){$tmp=1}else{$tmp=0}};：/^>/ ：检测行是否以 > 开端，这常常暗示 FASTA 过错中的序列 ID 行。**if(/Homo/)**：如果 ID 行中包含“Homo”（指代东谈主类关系的序列），则将 $tmp 缓助为 1（即允许输出该序列的标记）；不然缓助为 0（放置该序列）。这一步细目每条序列是否为东谈主类序列，仅料理包含 Homo 的序列。next if $tmp!=1;： next if 图片
Bowtie和Bowtie2的区别是什么：
Bowtie：经受基于 Burrows-Wheeler 变换（BWT）和 FM-index 的算法，安妥对短序列（常常为小于 50bp 的短 RNA 或短读长 DNA）进行快速比对。Bowtie2：经受了更复杂的比对算法，使用 Burrows-Wheeler 变换和动态规画算法来维持长片断的局部和全局比对，因此安妥较长的读长（一般在 50bp 以上），包括 DNA 和 RNA-seq 数据。bowtie-build hairpin.human.fa hsa-hairpin-bowtie-index bowtie-build mature.human.fa hsa-mature-bowtie-index # check ls -lh
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5.下载数据勾选念念要下载的数据，并点击accession list，并把list放入mirna文献夹中
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cd ../ cd ./mirna # check ls -lh
使用prefetech下载数据，这里需要把SRRlist和SRA toolkit软件装置好。除了这种相貌，咱们也不错采选aspera下载相貌
nohup bash -c 'cat SRR_Acc_List.txt | while read id; do echo "Downloading $id" prefetch $id done' &> download.log &
把sra数据批量调遣为fastq数据
# 当先需要知谈fastq-dump用具的位置 which fastq-dump # /opt/anaconda3/envs/miRNA_x86_64/bin/fastq-dump # 稽察文献夹中的数据是何如样的 ls # 要明确一下echo和SRR的ID情况 # 输入进末端的时间一定要再三明确代码情况 dump=/opt/anaconda3/envs/miRNA_x86_64/bin/fastq-dump echo {02..25} |sed 's/ /\n/g' |while read id; \ do ( $dump -O ./ --gzip --split-3 SRR154179${id}) ;\ done # 数据有点大 笔者就分开下载了 dump=/opt/anaconda3/envs/miRNA_x86_64/bin/fastq-dump echo {35..50} | sed 's/ /\n/g' | while read id; do ($dump -O ./ --gzip --split-3 SRR154179${id}) done{02..25} 会生成一个从 02 到 25 的数字序列。sed 's/ /\n/g' 将生成的序列号中的空格替换为换行符，以便逐行读取数字。while read id; do ... done 酿成一个轮回，逐行读取序列号并存储在变量 id 中。其中 {id}：指定待调遣的 SRA 文献，${id} 会插入轮回读取的数字部分，生成雷同 SRR15417902、SRR15417903 等文献名。图片
6.数据质控和清洗数据质控稽察
# 对面前文献夹中扫数以fastq.gz文献进行质地截止 fastqc -t 2 -o ./ *.fastq.gz # 对面前文献夹中扫数以fastq.gz文献进行整合质地截止，输出到fastq_qc文献夹中 multiqc ./*zip -o ./fastq_qcfastqc：调用 FastQC 用具，用于分析测序数据的质地。-t 2：指定使用 2 个线程并行料理文献，以加速分析速率。-o ./：指定输出目次为面前目次（./），FastQC 生成的敷陈文献将保存在面前目次中。*.fastq.gz：匹配面前目次下扫数以 .fastq.gz 闭幕的文献，算作输入文献进行质地截止分析。
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进展数据清洗
# 查验文献压缩过错 file /Users/zaneflying/Desktop/miRNA_Z/mirna/SRR15417902.fastq.gz # trim+clean # 著述用了miRquant 2.0这个用具进行trim，但笔者仍是按照曾安分的进程进行料理 ls /Users/zaneflying/Desktop/miRNA_Z/mirna/*.gz | while read id; do echo $id gzip -cd $id | fastq_quality_filter -v -q 20 -p 80 -Q33 -i - -o tmp fastx_trimmer -v -f 1 -l 27 -m 15 -i tmp -Q33 -z -o ${id%%.*}_clean.fq.gz fastqc -t 2 -o ./ ${id%%.*}_clean.fq.gz done # check一下 ls -lh *_clean.fq.gz图片
7.数据比对把柄miRBase数据库下载的序列进行比对和定量。
# mature清洗和定量 index=/Users/zaneflying/Desktop/miRNA_Z/reference/hsa-mature-bowtie-index ls *_clean.fq.gz | while read id; do echo $id bowtie -p 2 -x $index $id -S tmp samtools view -bS -@ 2 tmp -o ${id}_mature.bam done # hairpin清洗和定量 index=/Users/zaneflying/Desktop/miRNA_Z/reference/hsa-hairpin-bowtie-index. ls *_clean.fq.gz | while read id; do echo $id bowtie -p 2 -x $index $id -S tmp samtools view -bS -@ 2 tmp -o ${id}_hairpin.bam done*ls _clean.fq.gz: 列出扫数以 _clean.fq.gz 闭幕的文献，即猜度理过的 miRNA 序列文献。while read id; do ... done: 使用 while 轮回逐一读取文献名并将其赋值给变量 id，然后对每个文献扩充轮回内的敕令。echo $id: 打印面前正在料理的文献名，用于查验进程。bowtie -p 2 -x 图片
对比恶果中发现只好1507条reads对应上，也等于说的确扫数都莫得比对上的情况，很隐晦。应该是我莫得学好：
然后尝试更换一下参考基因组，著述中提到的是hg19
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笔者这里使用GRCh38进行对比，不外这个并不是重心哈。下载流GRCh38程可见转录组上游分析进程推文。
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# 生成索引 bowtie2-build Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa GRCh38.dna # index索引条件 index=/Users/zaneflying/Desktop/miRNA_Z/GRCh38.113/GRCh38.dna # bowtie运转转机 ls *_clean.fq.gz | while read id do echo $id bowtie -p 2 -x $index $id -S tmp ; samtools view -bS -@ 2 tmp -o ${id}_genome.bam donels *_clean.fq.gz | while read id：列出面前目次下扫数文献名以 _clean.fq.gz 闭幕的文献。while read id 用来逐行读取这些文献名，并将文献名存储在变量 id 中。echo $id：打印面前正在料理的文献名，以便跟踪进程。bowtie -p 2 -x 图片
这个对比恶果情况就对付能“让东谈主接纳”啦~
8.数据定量著述顶用的是miRquant 2.0
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笔者使用featurecounts去定量， 需要先去miRBase高下载hsa.gff3
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# 下载hsa.gff文献,放到reference文献夹中 nohup wget ftp://mirbase.org/pub/mirbase/CURRENT/genomes/hsa.gff3 & # 如果聚积不好，就径直办动下载 # 装置subread conda install -c bioconda subread # 运转比对 gtf=/Users/zaneflying/Desktop/miRNA_Z/reference/hsa.gff3 featureCounts -T 2 -F gff -M -t miRNA -g Name -a $gtf -o all.counts.mature.txt *genome* 1>counts.mature.log 2>&1 featureCounts -T 2 -F gff -M -t miRNA_primary_transcript -g Name -a $gtf -o all.counts.hairpin.txt *genome* 1>counts.hairpin.log 2>&1featureCounts：调用 featureCounts 用具进行基因计数。-T 2：指定使用 2 个线程。-F gff：指定输入文献的笼统过错为 GFF。-M：允很多重比对的 reads（即与多个位置比对的 reads）。-t miRNA：在 GFF 文献中，采选类型为 miRNA 的条件，这样不错仅对老练 miRNA 计数。-g Name：采选 GFF 文献中 Name 字段算作基因 ID。-a
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因为比对有问题，定量也很难保证，是以拿到了矩阵也很难进行后续分析：图片
后续的分析基本上等同于转录组测序抒发量矩阵，等于互异分析等统计可视化：
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参考良友：Multiomic analysis of microRNA-mediated regulation reveals a proliferative axis involving miR-10b in fibrolamellar carcinoma. JCI Insight. 2022 Jun 8;7(11):e154743.DNAJB1-PRKACA fusion protein-regulated LINC00473 promotes tumor growth and alters mitochondrial fitness in fibrolamellar carcinoma. PLoS Genet 2024 Mar;20(3):e1011216.Chemical, Molecular, and Single-nucleus Analysis Reveal Chondroitin Sulfate Proteoglycan Aberrancy in Fibrolamellar Carcinoma. Cancer Res Commun 2022 Jul;2(7):663-678.生信手段树：跋文我确乎是看收场教学视频，以及配套的札记，可是不知谈为什么恶果就大相径庭，一个东谈主学习生信等于如斯的无聊和疼痛！
小RNA建库测序后的数据分析-实例教授随着生信手段树学习microRNA测序学习构建miRNA-seq数据分析环境miRNAseq数据分析这样多年了它的进程也莫得固定这5个miRNA构成的肺鳞癌会诊基因集在tcga数据库能复现吗什么，给你了你这样多miRNA靶基因查询R包和网页用具你竟然不知谈何如使用对miRNA进行go和kegg等功能数据库数据库笼统使用miRNAtap数据源索取miRNA的预计靶基因恶果谁说Windows下无法作念生信分析（植物miRNA gene预计给你看）你但愿这个探针笼统到卵白编码基因仍是miRNA的基因呢如果miRNA的3p和5p功能不雷同miRNA、LncRNA、CircRNA靠谱小结贪图MiRNA–mRNA抒发关系性使用多个网页用具预计MiRNA–mRNA互相作用一篇著述学会miRNA-seq分析致谢：感谢曾安分以及生信手段树团队整体成员。
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